在生物体内，蛋白质并非以单体形式行使功能，而是通过与其他蛋白质、核酸或小分子化合物发生相互作用，以执行各类生物功能。针对生物体内更为复杂的三蛋白及以上蛋白质间相互作用，以及蛋白质与RNA、蛋白质与小分子化合物间的相互作用，传统的酵母双杂交系统已难以满足研究需求。基于此，研究者在酵母双杂交系统的基础上，发展出了酵母三杂交系统（Yeast Three-Hybrid System, Y3H）。
在Y3H系统中 ，第三个成分bridge与DNA结合结构域(BD)-诱饵融合蛋白和转录激活结构域(AD)-猎物融合蛋白一起表达。 bridge通过直接结合或蛋白质修饰 ，如磷酸化 ，被纳入诱饵和猎物之间的蛋白质相互作用。 bridge可以是蛋白、 RNA或小分子。如果诱饵和猎物(它们本身不会形成复合物)能与添加的bridge相互作用 ，报告基因就会被激活。酵母三杂交系统主要应用在以下方面：
一、分析蛋白质-蛋白质间的相互作用
蛋白质之间的相互作用调控大多数细胞功能。蛋白复合体的组装能启动 DNA 复制、转录、蛋白合成、基因重排、细胞生长及分化等，阐明蛋白间的相互作用也有助于破译信号转导机制。酵母三杂交系统可分析三个蛋白质之间的关系用该法还可从cDNA 文库克隆桥联蛋白，也可直接从化学文库中筛选影响三蛋白复合体形成的药物，阻断引发疾病的蛋白相互作用 ，从而达到治疗的目的。也可分析配体与受体的关系 ，在信号通路研究中 ，跨膜受体的细胞外结构域分别与 BD、AD 形成两个融合蛋白 ，配体表达使受体二聚化 ，从而激活报告基因的表达。
二、分析蛋白质- RNA间的相互作用
蛋白质-RNA 之间的相互作用是许多细胞过程的基础， 如转录、转录后修饰、核小体超分子结构的组装、 RNA 的稳定性、病毒RNA 包装， RNA运输和定位等 ，都涉及到两者之间的反应。酵母三杂交系统在活体细胞中检测相互作用 ，不需要纯化RNA 结合蛋白 ，已广泛应用于蛋白质 -RNA 相互作用的研究。
三、分析蛋白质-小分子化合物间的相互作用
小分子化合物与其蛋白质受体发生相互作用后 ，会引发一系列生物学或药理学效应 ，但这些小分子化合物的蛋白质受体还未被人们清楚地了解。酵母三杂交系统的应用则让人们能通过大规模的筛选寻找答案，其在药物发现中具有重要的意义。
Y3H系统操作简单 ，可用于细胞内核酸水平实验验证 ，具有比酵母双杂交系统更广泛的应用范围 ，可通过第三个蛋白使两个杂合蛋白相互靠近 ，用于研究两个蛋白和第三个蛋白间的相互作用。第三个成分不同 ，可以是蛋白、 RNA或小分子。 同时还可以通过菌落生长状态来研究第三个蛋白对其他两蛋白的作用方式（如促进或抑制） 。在研究蛋白质-蛋白质、 蛋白质-RNA和蛋白质-小分子化合物相互作用等诸多领域有巨大的应用。
